中国国际医疗器械设计与制造技术展览会(Medtec China)2018

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2018年 9月26日-28日 | 上海世博展览馆

小口径人工血管血液相容性的研究

2017-08-01

随着社会的发展,人类文明的进步,健康越来越受到人类的关注。但这一切仍然挡不住人类身体器官的老化、损伤和病变,人体的血管也不例外。据资料显示,仅2000年美国就有18万例人工血管植入手术,全球则有几十万例血管移植手术。由于各方面的原因,异体血管的移植根本无法也不可能提供如此多的相同血管。为此,医用人工血管的研制和开发具有非常重要的现实意义。目前,大口径人造血管的研究已取得突破性进展,在临床上得到广泛应用。而在小口径人造血管(直径小于6毫米)研究方面,由于存在血管栓塞以及生物相容性等方面的核心问题没有得到有效解决,离实际应用还有很大的距离。

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1 人造血管的研究现状

人造血管的开发和研制至今已有近60年的历史。自1952年Voorhees首次研制成功维纶(Vinyon“N”)人造血管,并于次年用于临床取得成功以来,人们陆续研究开发出了各种材料、多种成型和不同孔隙率的人造血管,并且对人造血管的性能有了深入的研究。以往用于人造血管制造的主要材料有涤纶、聚四氟乙烯、真丝等,而具备良好的顺应性、耐磨性、弹性、生物相容性及一定的抗凝血性的聚氨酯 (polyurethane,PU)则是目前被研究最多的人造血管制造材料。通过对PU材料进行碳化或其它特殊处理,可明显提高其强度,防止降解,保持良好的顺应性,使用聚氨酯材料生产小口径人造血管与膨化聚四氟乙烯(ePTFE)血管对比表明,PU血管在更短的时间内实现了内皮化,新生内膜厚度明显比ePTFE血管内膜薄而均匀,并且血管通畅率好,能得到较好的小口径人造血管。

1·1 几种特殊类型的人造血管

1·1·1 腔面内衬内皮细胞的人造血管。血栓是人工移植材料植入体内后临床失败的主要原因。在人造血管表面种植血管内皮细胞可以形成一个类似体内血管的抗栓表层,可提高材料的血液相容性,特别是提高了小口径人造血管的通畅率。

1·1·2 自体组织片移植型人造血管。人造血管腔面经自体血管碎片移植,亦可得到快速新生内膜,在动物实验中已得到了良好的结果。将自体静脉组织碎片经注射器注水压力使其镶嵌于人造血管空隙,提供内皮细胞,在此基础上在体内形成内皮细胞层。此方法的缺点是需特殊设备和技术,但可以利用带负电荷的肝素中和带正电荷的胶原,克服血栓形成,在小口径动脉移植领域已有长期存活者的报告。

1·1·3 复合壁人造血管。1982年Wesolow提出了一种可吸收纤维组分的人造血管,移植时,网孔小,可减少渗血,植入体内后,可吸收纤维被吸收,网孔变大,利于新生内膜的形成。

1·1·4 表面具有抗血栓的人造血管。使用祛聚、抗凝、溶血栓药物处理人造血管内壁,使人造血管具有一层抗血栓膜面,主要采用抗凝剂肝素固化,虽然肝素化表面能短期克服血液与人造血管的相互作用,但如何适宜长期抗凝作用仍有待进一步研究。

2 人造血管血液相容性

所谓血液相容性是指材料与血液接触后,不引起血浆蛋白的变性 ,不破坏血液的有效成分,不导致血液的凝固和血栓的形成。血液相容性是制约生物材料在血液环境中应用的最为重要的性质之一。当材料与血液直接接触时作为异物植入的材料可能引起一系列不良生物反应,如溶血、凝血、炎症反应等。理想的人造血管应有良好的血液相容性。小口径人造血管存在的主要问题是人造血管完全没有抗血栓性,血液流经内腔时,由于血流量小,流速慢,在人造血管腔面易形成附壁血栓,随之血凝亢进,血流更缓慢,血栓层增厚,最终导致人造血管闭塞。晚期平滑肌的过度增生使内膜增厚,小口径血管腔变得更窄,也是造成血管重建失败的一个主要原因。

2.1 提高血液相容性的方法

2.1.1 材料表面的接技改性。材料表面的接枝改性是从减少材料与血液成分相互作用,阻抗血浆蛋白吸附的角度,通过接枝亲水性基团或疏水性基团来改善血液相容性的。极端亲水性表面的材料,由于界面自由能大大降低,减少了材料表面对血液中多种组分的作用 ,因而呈现优良的抗凝血性。而极端疏水性表面的材料,由于表面能低,与血液各组分作用小,同样可呈现优良的抗凝血性。因此,以表面接枝来改变材料表面的亲/疏水性是提高材料抗凝血性的一个重要途径。可通过表面接枝方法,将丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺及其他一些亲水性单体接枝到聚氨酯表面。血液相容性评价表明,这类表面确有优良的抗凝血性。而 Han在 SPU上接枝全氟代烷基后,发现这种极端亲水性聚氨酯确实具有相当的抗凝血性。此外,在表面接枝聚环氧乙烷(PEO)侧链已证明是一种有广泛前途的方法。

2.1.2 材料表面负载电荷。由于血液中多种组分 (如血红蛋白、血小板、部分血浆蛋白质等)在血液环境中呈负电性,血管内壁也呈负电性,因此人们认为静电排斥作用可以阻碍血浆蛋白及血小板等物质的吸附,从而有利于抗凝血。用阴离子修饰材料表面来提高抗凝血性能已被广泛研究。但事实上由于材料表面吸附蛋白质层及血液中阳离子的存在,以材料–血液的静电作用理论来设计抗凝血材料表面有很大欠缺。

2.1.3 材料表面生物化。生物内的凝血与抗凝血是一个相互制约的平衡系统,许多生物活性物质都有较高的抗凝血活性。因而,将这些具有抗凝血功能的生物活性物质通过共价键合、离子键合、交联、吸附等方式负载到材料表面是提高血液相容性的有效手段。依据表面负载生物活性物质不同的抗凝血机理,这类材料可分为两类:一类是抗凝材料。表面负载肝素、前列腺素、白蛋白等活性物质,能抑制多凝血酶原的活化 ,阻抗血小板粘附。其中以肝素化高分子材料的研究最多。另一类是纤溶材料。表面负载尿激酶、纤维蛋白溶酶、链激酶等活性物质,具有纤溶作用,可溶解材料表面已形成的血栓。这类生物活性材料的研究相对较少,但纤溶在抗凝血方面的作用正日益受到重视。由于抗凝(阻止血栓形成)和纤溶(溶解已形成的血栓)是理想血液相容性材料的两个不可分割的重要方面。因此,最近的研究已经开始尝试将这两种活性物质集于同一高分子材料,制得一种同时具有抗凝血和纤溶活性的新型血液相容性材料。

依据天然抗凝与纤溶物质的活性官能团、活性片段,用磺酸基、磺胺基、羧酸基、磷脂极性基团等对材料表面进行修饰,也是获得较好血液相容性的手段之一 。

2.1.4 材料表面微相分离。与血液接触的血管内膜是由上皮细胞构成的,细胞膜是细胞表面结构的“核心”部分。按照生物膜流动镶嵌模型,这层生物膜骨架为脂质双分子层,蛋白质镶嵌其中。脂质双分子层以非极性基团相对,极性基团向外,形成亲水区,与蛋白质疏水区共同形成微观非均相结构。因此,材料表面微相分离也是获得良好血液相容性的有效途径。

人们对嵌段聚醚氨酯(SPEU)的大量研究充分证明了具有微相分离结构的材料,尤其是同时合并亲/疏水性成分达到一定平衡值时,具有良好的抗凝血性。至于这类材料的抗凝血机理,Nakajima曾提出覆盖控制假说。当微相分离材料和血液接触时,立即吸附血浆蛋白,亲硫/水性不同的蛋白质被选择性地吸附到不同微区,这种特定的蛋白质吸附层不会激活血小板表面的糖蛋白,血小板就不以异物来识别,从而阻碍了凝血的发生。

2.1.5 材料表面内皮化。材料表面内皮化是抗凝血的研究的新动向。内皮化的表面主要是指伪内膜化表面或内皮细胞和高分子的杂化表面。

伪内膜化表面是指当材料与血液接触时,在两者界面上会先形成一层稳定的红色血栓膜,成分为血浆蛋白质、血小板、纤维蛋白、白细胞等。进而有成纤细胞、内皮细胞在此膜上生长形成了一种结构与血管壁类同的内膜 ,即所谓伪内膜(pseudointima)。目前,表皮伪内膜的聚四氟乙烯人工血管已在临床上得到了应用。

值得注意的是,人工血管的伪内膜如果过厚,营养将供养不上,细胞会坏死脱落,使得裸露的部分发生凝血。为此进行了大量研究来控制伪内膜的厚度。如多孔性的聚四氯乙烯浸入水溶性的聚乙烯醇中,在表面形成多孔性亲水膜,减少对血浆蛋白的吸附。人工血管壁形成的伪内膜并非真正意义上的血管内膜,由于形成的蛋白质层的成分和厚度并不能得到很好地控制,目前尽管采取了一些改进措施,但人工血管壁上这层伪内膜还是没有达到和移植部位有效的相容性。

材料表面内皮化是抗凝血的研究的新动向。由于人体内皮细胞组成的血管内壁是目前知道的唯一的血液相容性物质。因此,人们仿照人体血管,使内皮细胞和高分子材料杂化,即在材料表面培养内皮细胞,使其最终生长出一层内皮。这对于材料的血液相容性的改善,尤其是小口径人工血管的血液相容性的改善,将是一个极理想的途径。但这种表面的稳定性还存在着问题,实验证明利用促进内皮细胞粘附的物质如纤维蛋白、纤维蛋白原或抗内皮细胞抗体是一种有效使内皮细胞和人工合成材料稳定结合的途径。

2.2 血液相容性的测试

我们正在研究聚氨酯与不同织物按不同百分比混合制成的人造血管的血液相容性,以期依据中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价标准GB/Tl6886》、ISO 10993和国内外科研文献报道的方法,对合成人造血管的材料进行血液相容性初步评价。

2.2.1 材料的溶血率实验

将待测材料剪成条状,装人试管内,加0.9%NaCl溶液10 ml;阳性对照采用蒸馏水,阴性用0.9%的NaCl溶液。采用新鲜ACD抗凝兔血(血:3.8%柠檬酸钠=4:1),全部试管放人37℃水浴中预温30min,各加稀释新鲜抗凝兔血0.2 ml(兔血:生理盐水二4:5),继续37℃水浴中保温1h,离心5min(2500 r/min),取上清液,在分光光度计545 nm处测取各管吸光度(OD)值。阳性吸光度值为0.8士0.3,阴性对照管吸光度应不大于0.03。溶血率按下式计算:

材料的溶血率高表明对血细胞(主要是红细胞)的破坏程度大。溶血率与材料的性质有关,若材料的溶血率>5%,则说明材料符合医用材料的溶血率试验要求,若溶血率<5%,则预示试验材料有溶血作用。

2.2.2 复钙时间实验

抽取新鲜兔血5 mL,以质量比 9:l加人0.13 mol/L枸橼酸钠溶液抗凝,取全血3mL,5000 r/min离心15 min取出上清液血浆备用。

将待测材料剪成0.5 cm x 0.5 cm的小条,放人0.9%NaC1溶液中浸泡24 h,然后移至试管底部,加人0.2 mL上清液,再加人0.2mL 0.025mol/L CaC12溶液,并开始计时,轻轻摇晃试管使CaC12溶液与上清液混和均匀,实验在37℃恒温水浴进行。当试管中出现一丝白色纤状沉淀时,记录时间。

复钙化时间测定是在已除去 ca2+的血浆中重新加入 ca2+,测定血液出现凝固的时间即复钙时间,其意义在于检测内源凝血系统 。当血液中纤维蛋白原、凝血酶原等凝血因子缺乏或有抗凝物质存在时,复钙时间会有所延长。

2.2.3 动态凝血时间实验

将膜剪成 0.5 cm x 0.5 cm的小条置于小烧杯底部的中心,在 37℃恒温 5 min后,向薄膜中心注人0.25 mL柠檬酸钠抗凝兔血 ,恒温 5 min后 ,向血液中注人 0.02 mL CaC12水溶液(0.2 mol/L),开始记时,摇晃小烧杯 1 min,使 CaC12与血混和均匀,盖好烧杯再恒温 5 min,取出烧杯,向烧杯中加入 50 mL蒸馏水,摇晃小烧杯 10 min,取上清液,用分光光度计测量血水在 540 am处的吸光度。 以含 0.25 mL全血的 50 mL蒸馏水作为对照,其相对吸光度作为 100。其抗凝血性能定义为:

BCI=(Is/Iw )X 100

式中,Is为血液和CaC12的混和液与样品接触设定时间后血液的相对吸光度;Iw为血液与一定量的蒸馏水混和后的相对吸光度。

体外动态凝血时间试验的目的是检测内源性凝血因子被激活的程度,以观察材料对凝血时间的影响,根据相对吸光度值变化的快慢程度来评价材料抗凝血性能的优劣。随着时间的延长,相对吸光度都呈下降的势,ACD全血中加人 Ca2+ 后会启动凝血过程,时间越长,血栓形成的越多,血液稀释液的相对吸光度越低。

若曲线缓慢向下倾斜且经历时间长,表示内源性凝血因子被激活的程度低,材料的抗凝血性能优良。曲线若呈急陡向下倾斜且经历时间短,表示内源性凝血因子被激活的程度高,材料的抗凝血性差。通常规定OD>0.1为初凝时间,OD>0.01为全凝时间。根据动态凝血时间曲线可求出材料的初凝时间,它也是判断材料抗凝血性能的优劣的一个指标。

2.2.4 材科的血小板黏附实验

在硅化系统中,采兔心脏ACD抗凝血10 ml离心10 min(100 g,250C)后取上层清液富血小板血浆(Platelet-rich -plasma, PRP),置于干净硅化试管中。材料(1X1 cm,厚约0. 2 mm)经洗涤后放人生理盐水中浸泡24 h,再放人新鲜PRP中,37 ℃孵育1h,取出用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤,2%戊二醛固定液中固定12h;用50%→75%→95%→100%梯度的乙醇相继脱水各10-15min,50%→75%→95%→100%梯度的乙酸异戊酯(第二组分为乙醇)脱水各10-15 min;取出样品,CO2临界点干燥后镀金,最后在扫描电镜仪上观察血小板形态及个数。阳性对照用未修饰的材料。

血小板豁附与凝聚是材料诱导血液凝血的重要途径,通过阴性和阳性及材料与血液接触60min时表面黏附血小板的扫描电镜照片,可以了解血小板在材料表面黏附、变形和聚集的情况。阳性结果为材料黏附的血小板很多,或伴随严重变形,伪足和细胞基质扩展明显,聚集态势形成。

2.2.5材料的凝血时间实验

将各种材料涂于玻璃管内壁,处理方法同上所述,放在37℃恒温水浴箱内恒温,硅化玻璃试管和空白玻璃试管分别为阴阳性对照。采用Lee-White氏法,兔心脏取血,血液进人注射器时即刻计时。取血后,沿管壁注人血液1 ml,置于37℃水浴箱内;4 min后每隔30s,将试管倾斜30°一次,观察至管倾斜90°血液不再流动为凝固时间。

凝血时间实验是用于判断材料对全血凝固时间的影响。

2.2.6材料的凝血酶原时间实验

将材料涂于玻璃管内壁(同上),玻璃试管、硅化玻璃试管为对照。采用Quick氏法[21],试材管内加人PRP,再加人0.1ml兔脑浸提液,置37℃水浴 2 min;加人已预温37℃的0.025mol/L CaCI2溶液0.1 ml,同时计时,立即摇动数次,浸人水浴;5-8 s从水浴移出试管,连续倾斜,至出现凝块,为凝固时间。各试验管和对照管,均取3次以上的平均值。

凝血酶原时间试验用于判断材料对凝血酶原因子的激活所致的凝血时间的影响。若材料比正常(玻璃)对照的凝血酶原时间超过 3s,说明材料激活凝血酶原因子的能力比玻璃低。

3 结论

解决人造血管的血液相容性问题是其在生物医学领域应用的关键。长期以来,在解决材料的血液相容性问题上,人们对材料表面的修饰研究得较多,如对材料进行表面分子设计,改善表面的亲/疏水性、引入带电基团、负载生物活性物质等,以尽量减轻血栓的形成来提高材料的血液相容性。然而,处于生物系统中的材料由于接触到体液、有机大分子、酶、自由基、细胞等多种因素,其生物学环境极为复杂,表面修饰的方法对血液相容性的改善有限。因此,应用组织工程的方法在材料表面原位培养人体内皮细胞使材料内皮化,成为改善血液相容性的重要途径。此外,我们正在尝试开发以具有优良径向弹性的小口径管状针织物为支撑,与具有良好生物相容性的聚氨酯复合,制备出完全模仿人体正常血管解剖结构的人造血管,同时把能改善人造血管抗凝血性的药物,通过特殊的方法复合到蚕丝超细粉体内(平均粒径>2微米),这种重新架构出的固体微胶囊,利用其缓释作用来改善人造血管的抗凝血性,以攻克目前小口径人造血管的国际难题。

来源:医用塑料网