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一文了解POCT新技术对于新材料的需求

2020-06-05

侧向流层析技术是20世纪80年代末在抗体技术,标记技术和材料技术基础上发展起来的一项新型的体外诊断技术,具有快速,简便,经济的优点,现已经广泛的应用于医院检测,食品检测,环监,农业和畜牧业,出入境检验检疫,法医等领域。

 

一个典型的侧向层析检测试纸条主要是由四个部分组成:样品垫,释放垫,硝酸纤维酯膜吸收垫。这四部分按顺序贴在一个具有粘性的背衬上,每一部分之间会有不同程度的重叠从而使样品的流动具有连续性,同时对整个体系提供支撑。这个体系通常会放在一个塑料的卡夹里,卡夹会有样品窗和结果读取的窗。同时整个体系至少需要两种抗体,一种标记偶联物,缓冲液和封闭剂等。

 

侧向流装置中的最常见的问题之一为不均一性,往往是由于装置隐藏的复杂性所引起的:使用组件较多所导致的材料间兼容性以及材料本身的不完美性都会造成很多问题。

 

因此固相材料的选择和不同材料之间的搭配通常会占据开发者的很多时间。为了克服传统材料所带来的局限性,Whatman创新性的研发了FUSION5。

 

FUSION5是一种以玻璃微纤维为主框架的复合材料,它包含特殊的高分子材料,可以在提高机械强度的同时拥有强大的亲水特性。它的独特之处在于,既可以可作为侧向流系统中单一组分使用也可以成为侧向流系统单一组成材料。

 

1、样品垫

FUSION5是以玻璃纤维为基础的材料,玻璃纤维的血液分离作用是众所周知的。红细胞被吸引到玻璃纤维表面并被困在材料的纤维中。当新鲜血液加到FUSION5上后,分离出的血清量与离心分离出的血清量相似。在40微升的新鲜血液加到FUSION5上后,大概可以分理到21微升的血清样品,这大约等于93%的离心法分离出的血清量。

图1 显示FUSION5和离心产生的血清成分(数字表示为离心值的百分比)(例如胆固醇,总蛋白和IgG)具有基本相同的特性。这些结果表明,FUSION 5的检测性能可以在各个测试平台上进行推断。 

图1. FUSION5 分离的血清量占离心法分离血清量的比例

 

2、释放垫

释放垫的主要作用是吸收有颜色的标记微球,使其干燥后稳定的保存在其中,当样品的待测物流到释放垫后,它又可以迅速的与液体融为一体并和待测物形成一个复合物一起流向反应膜。在侧向产品的开发过程中释放垫的选择和优化通常被认为是非常关键的。但有时候结合物释放过程中的问题并不是由于释放垫材料本身造成的。这是因为,通常胶体金在液态状态下是很稳定的。这种稳定性可以持续一年以上,有时5年以上的胶体金使用起来也没有问题。他们可以稳定的存在于液体状态下是因为在胶体颗粒之间由相互排斥的电荷使它们不会聚集在一起。但是在侧向流中,胶体金要释放在释放垫中,并且干燥后,长期保存在释放垫中。干燥后胶体金颗粒会倾向于聚集在一起,当他们聚集后就很难再彼此分开。所以,释放垫的干燥是非常关键的步骤。

侧向流中使用的所有胶体金微球都是疏水的,带有负电荷的,他们被抗体包被,从而和目标分子相互作用。FUSION5 是带有负电同时亲水的玻璃纤维。作为释放垫,FUSION5和胶体金之间没有强的相互吸引力,这样在结合物释放过程中不会有阻力。

 

 

作为释放垫FUSION5的释放效率非常高

当使用FUSION5 作为释放垫需要注意以下几点:

2.1 使用低浓度的亲水多聚物(polymer)或表面活性剂(surfactant)减少微球之间的疏水作用力;

2.2 使用低离子浓度 (Ionic strength) 溶液。因为干燥后的释放垫盐的浓度会升高,这回造成微球的聚集;

2.3尽量减低蛋白浓度,这样会减低干燥过程中的分子疏水作用力。

2.4 结合物的pH要维持再蛋白等电点 (pI) 以上,这样才能保证所有组分带负电。

表1. FUSION5的结合物释放缓冲液

3、反应膜

如使用硝酸纤维素膜不同,使用FUSION5作为反应膜替代硝酸纤维酯膜不可直接将蛋白包备到材料表面,直接包备会减低蛋白载检测线和对照线与目标物质结合量,从而降低反应的灵敏度。以Fusion 5作为反应膜使用,需要将蛋白包备到微球表面,再将微球包备到材料的表面,虽然信号值能够满足要求,但这为生产过程增添了步骤,所以目前并没有很多工业客户真正采用FUSION5作为反应膜。

 

4 、吸收垫

虽然玻纤材料也可以作为吸收垫材料,但是考虑成本因素,绝大多数的吸收垫还是以性价比较高的棉纤维材质为主。

 

除了传统的侧向流层析上的应用之外,侧向流与核酸扩增相结合以及以及制备DNA扩增芯片也成为了未来发展的重要方向,很多学者在这两个方向均做出了积极的贡献:

 

Chua A., Yean CY.等以Fusion 5作为载体将侧向层析技术与核酸扩增检测有效结合的快速检测方式(7)。目前大多数聚合酶链式反应或者恒温核酸扩征反应都是使用SYBR green,Taq 探针 (Taq probe)或者分子信标(molecular beacon)进行实时监测。或使用琼脂糖凝胶进行在反应结束后监测目标物是否得到了扩增。但是实时监测需要有特定的仪器进行检测,琼脂糖凝胶则需要在实验室的环境下进行。这都会增加聚合酶链式反应作为检测技术的成本。但使用侧向免疫层析技术检测核酸扩增的结果则无需复杂的设备或严格的实验环境使核酸检测结果可现场读取, 侧向免疫检测还可根据设计者在设计扩增引物时加入标定核酸序列呈现不同的应用领域。对于侧向免疫层析技术检测分子扩增的应用,目前也有不少成功的科研案例,同时也有部分公司已经上市类似的检测产品。

 

Fusion5为主要材料制备DNA 扩增芯片(6)。玻璃纤维含有高浓度的二氧化硅。在特定的pH 盐溶液中带负电的脱氧核糖核酸可以特异性的吸附到玻璃纤维表面。从而和细胞裂解后的杂质分开。再通过pH的调节将吸附到玻璃纤维膜上的脱氧核糖核酸洗脱下来。洗脱后的脱氧核糖核酸适用于多种分子生物学分析:实时聚合酶链式反应(qPCR),微列阵 (Microarray), 二代测序(NGS)等等。最近芯片实验室 (lap-on-chip)的概念非常流行,未经纯化的样品直接放入一体化的芯片中,一定时间后直接在机器上读出结果。芯片实验室首先可以避免污染,一个封闭的系统对于高传染性疾病检测非常重要。实验人员不必和样品有过多的接触就可以拿到鉴定结果。其次可以减少样品用量,大多数芯片实验室都是使用微流控技术设计芯片,少量的样品在封闭的环境中通过在不同的反应室里进行裂解,吸附,洗脱,最后在扩增。这样封闭的系统大大减少的样品的损失。Fusion5 在不同的芯片实验室的项目中都被作为脱氧核糖核酸的纯化介体被组装进不同的芯片中。而且不同的实验室结果都显示出,与其他玻璃纤维相比,Fusion5可以有效的提取高浓度脱氧核糖核酸(DNA)使下游检测结果时间缩短(5)。这说明将Fusion5用于脱氧核糖核酸的提取可以有效的提取到高浓度目标物,从而提高整个检测流程的敏感度。当然Fusion 5 在POCT新技术上的应用远远不止这两项,这里就不再一一赘述。

 

来源:医疗器械创新网

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