中国国际医疗器械设计与制造技术展览会(Medtec China)2018

专注于为医疗器械研发与生产服务

2021年9月1-3日 | 上海世博展览馆2&4号馆

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生物3D打印的关键技术及骨科应用进展

2020-08-07

摘要

 

骨缺损修复重建是骨科领域长期以来的研究热点,组织工程及干细胞技术在促进骨再生及治疗骨缺损的研究取得了一系列的重要成果。近年来,3D打印技术和组织工程、干细胞技术相结合的生物3D打印通过精确控制支架的外形、内部结构并将生物材料、干细胞和/或细胞打印成三维生物功能体,在优化骨缺损修复组织的几何外形、力学性能及生物功能上具有明显优势,相关研究取得了一系列的重要进展。生物3D打印在骨科应用的常见打印方式:①喷墨式打印;②挤出式打印;③激光辅助打印;④光固化成型打印;⑤基于微阀的打印,各种打印方式及原理并不相同,且各有优缺点,适用的"生物墨水"也不一样。骨科生物3D打印的关键技术包括:①打印前的影像数据获取及3D结构设计方法;②适合3D打印、可用于组织工程、增强成骨效果的复合生物支架材料的研发与应用;③确保移植物的生物性能的干细胞选择及诱导多能干细胞技术;④提高生物打印体组织成熟化及生物特征的体外生物反应器技术。生物3D打印研究领域发表的文献自2008年以来呈持续高增长趋势,使用文献计量可视化分析软件VOS viewer对出现的高频关键词建立共词矩阵并绘制关键词共现网络图谱分析,生物物3D打印研究热点为利用组织工程方法3D打印组织支架,同时进行细胞存活及药物效应的研究,生物3D打印的仪器与方法也是研究热点之一。

 

3D打印又称快速成型技术,是以数字文件为基础,采用粉末状黏合材料如金属、高分子可降解材料等经过逐层堆叠累积的方式制造出三维实体的技术,以病理模型、导航模板、假体与内植物、外固定支具等形式广泛应用于骨科临床治疗[1,2,3,4,5]。生物打印是3D打印技术中重要的分支,指将细胞、生长因子及支架结合在一起形成完整的整体结构,同时能实现不同类型细胞在支架内部的准确定位,通过细胞、生长因子及支架之间的相互作用,通过软件分层离散和数控成型的方法将生物材料和"生物墨水"定位装配,从而制造出个性化医疗器械、辅助器具、组织工程支架、组织器官甚至生命体等制品,实现组织功能化[6]。

 

作为生命科学与现代制造学交叉的新型学科——生物3D打印,其优势体现在:①能够快速构建出宏观以及微观结构仿生的组织工程支架;②构建三维的"多细胞/材料"体系,在组织成分和细胞构成上更接近天然组织;③可以精确地控制细胞和材料在时间和空间上的分布;④构建仿生的细胞外基质环境等。根据其原理和方法,可将生物3D打印被分为三个过程:首先对打印前的数据进行收集及软件建模,主要包括3D影像资料采集、数字化三维设计及打印材料的选择等;其次,使用相应的生物3D打印机,将选定的材料与细胞制成"生物墨水",设定相关的打印参数,将"生物墨水"打印成型;最后,加工、改善生物打印体的仿生结构、机械性能和生物活性等并进行后续培养,最终制造出充分满足实际需求的生物体,这也是日后实现成熟的组织、器官打印的一个不可或缺的步骤[7](图1)。

 

01检索策略

 

为了解掌握生物3D打印及骨科应用进展,本文以"生物打印"和"组织工程"为中文检索词检索中国知网、万方数据网数据库;并以"tissue fabrication"and"bioprinting"为英文检索词检索PubMed、Springer数据库,各检索词之间均采用"and"运算法则进行检索,筛选自2008年1月1日至2018年11月1日的文献。

 

文献纳入标准:①生物3D打印的相关文章;②组织工程相关文章;③生物3D打印与组织工程在骨科修复的研究、应用。排除标准:①重复文献;②中英文以外语言的文献;③无法获得全文的文献;④与研究主旨不相关的文文献;⑤文献类型为评论、来信。

 

检索后获得相关文献1746篇,用软件排除重复文献281篇,纳入非重复性文献1 465篇,浏览题目和摘要排除文献729篇,排除非中英文文献32篇,无法获得全文76篇,最终选取与本文主旨相关文献61篇(图2)。

 

02生物3D打印的方式 

 

根据工作原理,可将生物3D打印技术分为五种类型:喷墨式生物打印,挤出式生物打印,激光辅助生物打印,光固化成型生物打印和基于微阀的生物打印[8,9,10]。在这些技术中,挤出式生物打印技术已被广泛用于构建载有细胞的3D组织和器官。

 

(一)喷墨式生物打印

 

喷墨式生物打印机也称为基于液滴的生物打印机,使用热力或声学的方法将液滴喷射到基板上并逐层打印。在热喷墨生物打印中,通过电加热打印头产生"生物墨水"液滴,通过增加压力迫使液滴中的细胞离开喷嘴[11]。由细胞、支架材料和生长因子制成的生物墨水通过控制液滴大小和沉积速率可以精确堆积[12]。喷墨生物打印的一个明显缺点是"生物墨水"是具有低粘度的液体形式[9],这极大地限制了构造的高度,另一个明显缺点是3D构造的机械性能差,由于存在上述缺点,故基于喷墨的生物打印仍然处于大型器官生物3D打印的初期阶段,而基于挤出式生物打印已广泛用于大量研究。

 

(二)挤出式生物打印

 

挤出式生物打印是使用流体聚合物溶液或水凝胶作为生物聚合物的特定沉积过程[13]。挤出式生物打印机通常由配备有流体分配喷嘴(或头部)的三轴自动挤出系统组成[14]。在挤出过程中在计算机辅助设计(computer-assited design,CAD)模型的控制下将载有细胞的生物聚合物堆积成特定的结构。可以使用具有干细胞/异质生长因子的单喷嘴生物3D打印机或具有多个细胞谱系的多喷嘴生物3D打印机来制造异质组织和器官。挤出式生物打印的优势包括高细胞密度、3D结构大以及打印速度快,不足是目前缺乏具有良好生物相容性并且可以分层印刷成大结构聚合物的溶液或水凝胶[15,16]。

 

(三)激光辅助生物打印

 

激光辅助生物打印是基于激光脉冲在溶液和含有细胞的玻璃片之间产生高压气泡朝向集合基板[17,18]。它可以以高分辨率产生具有一系列粘度(1~300 mPa/s)聚合物的微细胞载体3D结构[19,20]。激光辅助生物打印的优点包括避免细胞及聚合物生物材料堵塞喷嘴,缺点是激光辅助生物3D打印机的成本高。

 

(四)光固化成型生物打印

 

光固化成型生物打印是一种基于光敏高分子(或聚合物)配方的固体自由成型无喷嘴技术,在光固化成型打印过程中可以添加许多生物材料[21]。光固化成型生物打印的优势在于速度和准确性高,其缺点是打印装置成本高以及光和光引发剂的细胞毒性[22,23]。

 

(五)基于微阀的生物打印

 

基于微阀的生物打印是一种按需滴落技术,其包括一个三轴可移动机器人平台和一系列电子微型阀头[24],每个微型阀头连接到具有气动压力的单个气体调节器,当气动压力克服开口处的流体粘度和表面张力时即可以沉积液体的"生物墨水"[25,26]。其主要优点是生物材料的同步喷射,缺点是它只能在有限的粘度范围(如1~200 mPa)和细胞浓度(106细胞/ml)内打印水凝胶[27]。

 

03生物3D打印的关键技术  

 

(一)图像数据获取及建模

 

生物3D打印过程始于3D结构的设计,设计文件可以通过CAD建模或通过使用生物医学成像技术(如CT或MR)来获得[28]。3D打印技术特别适用于制备个性化定制具有特定机械和结构支撑的多孔支架。Hollister等[29]使用基于图像的个性化定制数据驱动设计控制的方法,通过拓扑优化算法生成适当的CAD和计算机辅助加工(computer aided manufacturing,CAM)文件,应用聚合物复合矿物材料通过3D打印技术制作下颌角支架。3D打印也有利于在多层区域中生成具有生物和结构特性的支架,使其接近天然存在的组织结构[30]。骨软骨交界处是一个复杂的交叉边界,既可作为力传导的方法,也可作为保护性免疫屏障[31],使用化学、材料和空间线索来指导区域分化同时保持组织类型之间的强界面的功能性支架可以被打印。Bian等[32]通过显微计算机断层扫描(micro CT)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)用于研究软骨-骨过渡结构的微观结构,获得其形态特征及分布,通过CAD设计了仿生骨软骨支架的三维模型,进一步通过使用树脂的3D打印构建软骨下骨支架原型。这种梯度支架打印方法目前受限于可用3D打印机的制造分辨率,但最近的研究正在寻求开发可以使用更高分辨率的3D打印技术(如立体光刻技术)打印的新型生物材料[33]。

 

(二)生物墨水

 

最近,生物打印支架材料的研究重点是发展新型适合3D打印、可用于组织工程、增强成骨效果的复合生物材料。这些特性通过支持植入细胞的附着、增殖和成骨分化来增加支架的生物活性,同时在缺陷部位提供再生微环境和适当的机械支撑。Jakus等[34]开发了由90%羟基磷灰石组成的超弹性骨材料,其具有高矿物质含量通常赋予的材料硬度,但该材料表现出高的柔韧性和延展性,以允许外科医生容易地将其成形为不规则的几何形状,同时还保持了多孔微结构,这对于细胞重塑是有利的。Hung等[35]开发了一种打印嵌入聚己内酯的脱细胞骨的方法,通过增加脱细胞骨的重量百分比以改善支架的生物活性与羟基磷灰石和磷酸三钙这两种常用的合成骨替代物相比,它是一种更有效的骨诱导剂。Song等[36]通过3D打印在低温条件下制作了一个创新的多孔纳米双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate,BCP)/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)/富含血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)支架,打印的支架具有正常的孔隙结构和高孔隙连通性,可以促进骨髓间充质干细胞(marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)和内皮细胞的生长,以及营养物质和代谢废物的运输;Lin等[37]采用一种低温自动注浆成型技术,用常规的胶原-羟基磷灰石(collagen hydroxyapatite,CHA)复合材料来打印仿生3D支架,保持了大部分的原材料性能;打印的支架可以促进骨髓间质细胞增殖,并在体外促进成骨作用。在兔股骨髁缺陷模型中,在支架被分解前支架内的连接孔有助于细胞渗透和矿化;Kang等[38]应用生物可降解聚合物磷酸三钙(tricalcium phosphate,TCP)作为支架,提供足够的机械性能强度克服以往生物3D打印尺寸和形状的限制,通过多通道的生物3D打印机打印多种装载细胞的水凝胶来完成下颌骨、耳软骨和骨骼肌组织的打印。最近在矿化或金属生物材料的高孔隙率3D打印方面取得了进展,解决了将高强度但难以制造的材料应用于组织工程的挑战。这些发展包括通过直接墨水打印的高孔隙率氧化铝泡沫以及通过选择性激光烧结(selective laser sintering,SLS)3D打印方法制作的金属钛骨小梁结构和生物活性钙支架[39,40,41]。

 

(三)干细胞的来源和加工

 

载有细胞的支架在获得足够量的干细胞以及验证细胞功能、活力、免疫应答方面仍然存在困难,但完整的骨软骨复合组织已经在一些动物试验中使用并获得较好的结果[42,43,44,45]。大多数骨组织工程都集中在骨髓间充质干细胞(BMSCs)的使用上,然而,最近的研究表明:尽管具有相似的细胞表面标志物和基因表达谱,但来自不同解剖位置的BMSCs在功能上可以是不同的[46],其差异包括对外源性生长因子的反应谱[47]、分化为各种组织的倾向[48,49]以及基因、mRNA和蛋白质表达谱[49,50],由于这些差异,干细胞的选择对于确保移植物的功效可能是至关重要的。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是一种新兴的细胞类型,可用于组织特异性治疗和建模。研究人员开发了模拟iPSC体外分化为软骨细胞的方法,并将iPSCs用于治疗大鼠滑车沟中的软骨缺损[51]。目前,iPSC在临床中的使用受限于低重编程效率和基因组整合的安全性问题[52]。对非整合重编程策略的研究(包括非整合病毒载体、质粒载体和其他DNA、RNA或microRNA递送策略)已经为基因组整合提供了更安全、更有希望的替代方法[52]。未来可能会使用CRISPR-Cas9基因编辑等新兴技术从体细胞来源产生患者来源的iPSCs用于临床治疗[53,54]。

 

04体外生物反应器技术  

 

生物打印所制造出来的初始组织物,需要送入细胞培养器中,慢慢地将充满细胞的初始组织进行组织成熟化。对于工程骨和骨软骨复合组织,生物反应器被用于通过植入在整个支架中的细胞来增强细胞的氧和营养物质的传递,从而增强组织工程支架内的细胞分化和组织形成[55,56]。计算方法能优化种植和灌注方式,从而得到支架内更大的均匀性。Li等[57]介绍了BMSCs、富含血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)、β-TCP支架和生物反应器构建组织工程骨的新方法,使用该方法构建的组织工程骨在形态学和功能上显示出活跃的生物学特征。Ding等[58]报告一种带有内部传感器的计算机控制新型自主灌注生物反应器系统,可在整个培养期间非侵入性地监测灌注的培养基中的氧和pH水平,实验显示这种新型灌注生物反应器即使移植材料的培养时间较短,但仍可激活更大的活骨移植材料的能力。Kleinhans等[59]开发了一种新型生物反应器系统可产生在多孔L-乳酸-己内酯支架内标准化的流动条件,在不增加生长因子情况下仅通过机械刺激实现了早期成骨,不添加可溶性因子的开发过程符合生产质量管理规范(good manufacturing practices,GMP),使得该技术有可能加速临床转化。

 

05生物3D打印研究热点

 

1465篇非重复性文献自2008年以来呈持续高增长趋势(图3)。使用文献计量可视化分析软件VOS viewer(1.6.9,莱顿大学,荷兰)对1 465篇文献关键词进行分析,掌握该研究领域的发展趋势与研究热点。本文设定出现频次≥39次为高频关键词,建立共词矩阵并绘制关键词共现网络图谱,纳入32个高频关键词(表1)。通过VOSviewer进行共词聚类分析,采用"网络视图(Network Visualization)"进行共词聚类展示。一个节点代表一个关键词或术语,出现频次越高节点越大,一个颜色代表一个聚类,聚类是由共现频次高的关键词或者术语构成,图中的连线代表连接的两个关键词至少有一次共现在一篇文献里,关键词共现频次越高线越粗。在图4的关键词共现聚类视图,依颜色可将本文纳入的1 465篇非重复性文献分为四个聚类。

 

文献分为黄、绿、红、蓝四个聚类。每一个节点代表一个关键词或术语,其出现频次越高节点越大,连线代表连接的两个关键词至少有一次共现在一篇文献里,关键词共现频次越高线越粗,*表示该篇文章的一个主要关键词。

 

列举每个聚类中的关键词,并归纳总结主题,四个聚类分别为:# 1组织工程/方法;# 2生物打印/仪器/方法;# 3生物打印/组织支架;# 4生物打印/细胞存活/药物效应(表2)。由该关键词共现聚类视图分析可知,目前,生物3D打印研究热点为利用组织工程方法生物3D打印组织支架,同时进行细胞存活及药物效应的研究,生物3D打印的仪器与方法也是研究热点之一。

 

 

06思考与展望

 

创伤、肿瘤、感染等疾病是导致骨组织缺损的重要原因,而长段骨缺损的修复和功能重建也是骨科领域长期以来的难题和研究热点。目前,临床上常用于治疗骨缺损的可行方法主要包括自体骨移植、异体骨移植以及人造材料填补这三种,虽然自体骨移植是治疗骨缺损的"金标准",但自体骨取自患者的髂骨等部位,取骨量有限且伴随新的创伤,在骨缺损较大时难以满足临床需求;而异体骨经过处理可使其免疫原性降低,但同时也会造成骨传导、骨诱导能力的降低,此外,其传播感染性疾病的风险也不容忽视[60]。因而,骨科手术治疗的关键是选择更好的满足生理需求的植入物替代骨组织缺损重塑结构的完整性。然而,仅仅依靠传统的假体并不能完美的匹配不同患者之间骨骼的个体差异,不同疾病导致的骨缺损使骨骼的外形具有更多的不确定性[61]。因此,3D生物打印将是未来实现骨组织工程重建的最重要、最有效的手段。虽然3D生物打印技术已在微观和宏观层面上取得迅猛发展,使其在组织工程中的应用备受青睐,但仍未见临床应用方面的报导。

 

任何一种新技术的发展都无法避免困难与挑战,生物打印所需的"生物墨水"是现如今严重影响和制约发展的重要因素之一,寻找到具有合适性能的生物材料,如材料的生物相容性、降解性能、生物响应性、力学性质等,不仅要满足能够在不影响细胞活性的条件下在常温固化成型,更要保证支架内细胞的活性,并且实现血管化是目前骨组织工程的一个重大挑战,而成血管化是一个复杂的生理过程,需要细胞、支架及生长因子的共同参与,因而能满足成血管化的"生物墨水"亟待研究与开发。另一方面,优质的、适合的材料往往难以获得且成本极高,这也将是技术发展过程中所需要克服的又一大难题。因此,生物3D打印尚有许多技术难题需要突破,需要多学科跨领域合作研究。

 

 

伴随着人工智能兴起,起步较晚的国产医疗机器人正在加快发展,逐步扩大应用场景。5月26日,第十一届中国生物产业大会在武汉光谷发布本土健康企业的7项最新成果,首先推介的便是武汉兰丁公司的宫颈癌检测智能机器人。

 

《每日经济新闻》记者在大会现场了解到,多家企业正在推广医疗机器人,应用范围涵盖胃镜检查、腹腔手术、美容抗衰等,并且已有成熟产品进入国内医院,打破进口机器人在医院应用的垄断局面。

 

 

据主办方介绍,“LANDING”机器人通过筛查样本拨片进行自动化诊断,每月有108万例的样本检测能力,效率远远超过人工。目前,武汉兰丁公司与阿里巴巴的合作,使“LANDING”机器人在中国各地基层终端收集的大量细胞特征参数及数据,在云平台上完成分析诊断工作。

 

 

科技颠覆想象力,机器人在医疗领域的应用范围更加广泛。《每日经济新闻》记者注意到,多家企业在生物产业大会上重点推介医疗机器人产品。

 

患者吞下一粒胶囊,在胃里变成机器人进行螺旋式扫描,将检查图像实时传输至医生电脑,这便是安翰光电技术(武汉)有限公司研制的磁控胶囊胃镜机器人。该公司展位负责人程先生介绍,目前全国已有1000多家医疗机构应用了胶囊胃镜机器人,包括三甲医院、大型体检中心等,涵盖专业医疗和常规健康体检领域,年消耗量达50万粒。

 

据了解,这粒胶囊仅重5G,但包含了80多项科技创新专利,集成400多个精密元器件。上述负责人表示,在检查方面,胃镜机器人可以替代传统的电子胃镜,不过电子胃镜可以做小型的腔镜手术、切片等,胶囊机器人还不具备这些功能,但在进一步研发中。

 

苏州康多机器人有限公司则在大会上重点推介腹腔镜手术机器人系统,该公司展位负责人张辉介绍,这款手术机器人由医生控制台、支撑臂、手术器械三部分组成,通过机器人操作可以起到防止手抖、放大病灶视野等精确治疗的效果。

 

其实,在“机器换人”升级过程中,国产医疗机器人起步虽晚,但发展很快,不少上市公司将其作为下一风口进行布局。

 

2015年,制造装备公司楚天科技(行情300358,诊股)(300358,SZ)表示正在研发医药机器人和医疗机器人,一年后,首台医药无菌生产智能机器人下线,步入医药装备4.0时代;2017年11月,科大讯飞(行情002230,诊股)(002230,SZ)研发的医疗机器人“智医助理”通过临床执业医师综合笔试,目前已进入合肥基层卫生中心,辅助全科医生进行诊疗;2017年,埃斯顿(行情002747,诊股)(002747,SZ)收购美国Barrett 30%股权,全面进军康复医疗机器人市场,并计划与Barrett共同出资在中国境内成立一家新的合公司。

 

国产机器人拥有成本优势 在多家企业布局的背后,是医疗机器人巨大的市场潜力。普华永道中国发布的《医疗机器人宏观应用趋势与研究方向》显示,2014年,全球医疗机器人的市场价值是26亿美元,到2020年预计会达到76亿美元。

 

人均可支配收入的增加会促使高质量医疗需求的增长,而医疗机器人正好有出血少、精准度更高,恢复快的优势。整个发展趋势显示医疗机器人市场潜力巨大。

 

目前,国内医院的医疗机器人仍依赖进口,最为广泛应用的就是美国直觉外科公司制造的达芬奇手术机器人,2016年国内手术量突破1.5万台。

 

但是,进口医疗机器人价格昂贵,使得医疗费用也居高不下,如一台达芬奇机器人在国内售价2000万元左右,附带长期的耗材费用。

 

“进口机器人就算不用,一年的保养费都得80~100万元,每天开机费用就达1万元左右。”张辉表示,国外的机器人设备,主要包括维修费、保养费、耗材费等费用,所以价格居高不下。

 

随着国产医疗机器人发力,这一局面有望打破。此前,楚天科技研发的医药无菌生产机器人定价500万~600万元,而国际同类机器人定价800万~1000万元左右。

 

张辉告诉《每日经济新闻》记者,国产医疗机器人的优势是小型化、便捷化,还有国内的服务体系,针对三甲医院、县级医院等机构,可以实现分级应用,因此价格应该会比进口设备低一半左右,降低医疗成本。

 

来源:每日经济新闻

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