中国国际医疗器械设计与制造技术展览会(Medtec China)2021

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2021年9月1-3日 | 上海世博展览馆2&4号馆

生物材料在牙髓再生治疗中的应用

2021-03-16

引言
年轻恒牙具有非常独特的解剖结构。死髓年轻恒牙根尖开放、难以封闭,并且牙本质薄弱,不适合常规根管治疗。虽然使用氢氧化钙[Ca(OH)2]或三氧化聚合物(MTA)进行根尖诱导成形术可使根尖封闭,但是它既不会促进牙根发育,也不会恢复牙髓的免疫能力,使牙根丧失了进一步发育完成的机会(例如牙本质壁增厚和根尖发育成熟),从而增加了根折的风险。牙 髓-牙本质复合体的再生有助于维持天然牙列功能,特别是当外伤导致年轻恒牙牙根发育中断时。临床可用的再生策略,即引血,根管内封药:三联(TAP,环丙沙星、甲硝唑和米诺环素)和二联(DAP,无米诺环素)高浓度抗生素糊剂或Ca(OH)2。本文目的是探讨根管消毒药物的生物相容性以及生物材料(支架)、干细胞和生长因子在牙髓再生治疗中的应用。

根管消毒在牙髓再生治疗中的作用
常规抗菌治疗方法概述
在牙髓再生治疗中,根管消毒与血凝块的形成(即基于纤维蛋白的支架)在新生组织形成和牙根发育成熟中具有关键作用。尽管牙髓再生治疗具有良好的临床效果,但其生物学效果不可预知。根尖周病变愈合以及牙根发育不一定表明根管内形成了类似于牙髓-牙本质复合体的组织。临床上实现真正的牙髓再生仍然困难重重,特别是由于根管系统内存在残留的细菌/生物膜,因此需要既不危害干细胞分化又具有强大消毒效果的抗菌策略。

最早用于牙髓再生治疗的第一种抗菌剂是三抗糊剂(TAP)。一些研究证实,TAP尽管无法清除所有细菌,但是可以有效地消毒根管系统。TAP能够清除大约75%的病原体。由于牙本质小管的存在,与软组织相比,感染的牙齿更难消毒。位于牙本质小管深层的残余细菌,可在根管消毒后存活。TAP已在全世界广泛使用,一些病例报告显示,这3种抗生素的混合物可能会使牙齿染色,导致牙齿明显变色,造成美学方面的问题。这是由于TAP中的米诺环素成分所致,为了避免牙齿染色,可使用不染色的抗生素替代米诺环素,比如阿莫西林/克拉维酸、克拉霉素/磷霉素和头孢克洛。目前临床中可使用含有两种抗生素的抗菌糊剂,比如环丙沙星和甲硝唑组成的双抗糊剂(DAP)。尽管如此 ,与DAP相比,TAP可去除更多细菌。

除了具有抗菌作用或者造成牙齿染色外,牙髓再生治疗中使用的抗生素糊剂会对再生带来严重风险,因为高浓度的抗生素对牙髓干细胞(DPSC)和根尖牙乳头干细胞(SCAP)具有潜在毒性;此外,TAP可以抑制牙本质中生长因子的释放,因此可能影响再生过程。学者们已经尝试通过降低抗生素药物浓度来降低其细胞毒性。有研究比较了TAP与DAP在不同浓度(例如0.1 mg/ml、1 mg/ml和10 mg/ml)下的抗菌能力和细胞毒性,尽管浓度较低的糊剂无干细胞毒性,但不足以清除细菌,10 mg/ml的抗菌糊剂可有效降低细菌水平,但是它们的细胞毒性也更大。另一项类似研究测试了TAP和 DAP 在 0.01 mg/ml、 0.1 mg/ml、1 mg/ml、10 mg/ml和100 mg/ml浓度下的作用,发现浓度<1 mg/ml时对干细胞存活率(细胞存活率接近100%)没有显著影响,而浓度为1 mg/ml、10 mg/ml和100 mg/ml时,干细胞的存活率分别为58%、8%和1.3%。因此,TAP和DAP的最大消毒能力和最小细胞毒性之间难以取得平衡。为此,学者们提出了替代的抗菌策略,我们将在后文中探讨。

纳米纤维根管内药物递送系统
近年来,在牙科领域,静电纺丝技术已用于制造含抗生素的纳米纤维药物递送系统。将含抗生素的纳米纤维作为三维(3D)管状药物递送系统,放置在死髓牙的根管系统中,由于添加了低浓度抗生素,这些纳米纤维缓慢释放药物,清除感染,从而创造出有利于组织再生的无菌环境。

在静电纺丝过程中,制备含有所需浓度抗生素的聚合物溶液/溶体,以生产纳米纤维。将一种或几种抗生素掺入所选择的聚合物溶液,从而制作出具有窄谱或广谱作用(例如环丙沙星、甲硝唑和米诺环素等)、可抑制病原体生长的纤维。最近的一项研究使用人牙根片段上形成的粪肠球菌(Ef)生物膜测试含有环丙沙星的聚合物纳米纤维,发现25 wt.%环丙沙星较5 wt.%环丙沙星纳米纤维可最大限度地去除细菌生物膜。

为了提高纳米纤维的抗菌效果,并且基于使用TAP作为牙髓再生治疗标准的几项研究,进一步开发出了三联(甲硝唑、环丙沙星和米诺环素)抗生素洗脱纳米纤维,选择内氏放线菌,使用共聚焦激光扫描显微镜测定活/死细菌细胞,发现暴露于三联抗生素洗脱纳米纤维(即TAP支架)的感染样本中大量细菌死亡。

需要注意的是,上述研究主要针对兼性厌氧菌,然而原发性感染的根管中定植的主要是专性厌氧菌。因此,近期一项研究证实,牙龈卟啉单胞菌生物膜对三联抗生素洗脱纳米纤维也较为敏感。

与制备抗生素洗脱纤维相关的进一步研究,主要集中于改善牙本质染色问题。其中一项研究发现,与其他TAP糊剂相比,含有米诺环素或多西环素的纳米纤维使牙本质发生了相似的颜色变化,尽管多西环素处理组比米诺环素处理组的牙本质变色较浅。另一项研究旨在使用克林霉素,即另一种具有广谱作用的强效抗生素,替代米诺环素,测试其抗菌性能、细胞相容性和牙本质变色作用,发现这些改良的抗生素洗脱纳米纤维可能具有显著的抗菌作用和生物相容性,不会造成牙本质变色。同样重要的是,一项体外研究证实,克林霉素具有促血管生成活性,而血管生成是牙髓-牙本质复合体再生的关键步骤,因其对于氧气和营养物质向再生细胞的转运至关重要;相反,米诺环素可减少血管内皮生长因子的分泌和抑制内皮细胞的血管新生,从而影响血管生成。因此,在TAP中使用克林霉素替代米诺环素会使TAP更具生物活性,并可能提高细胞存活率,促进血管生成。

总之,相关研究提供了丰富的背景信息,不仅可以测试这些纳米纤维对体外多菌种生物膜的抗菌效果,还可以利用根尖周病的临床前动物模型探索其临床疗效。

替代的抗菌策略
其他替代抗生素洗脱纳米纤维的抗菌策略,也具有显著的根管消毒作用。例如,研究者制备了由聚(D-L-丙交酯-共-乙交酯)和玉米醇溶蛋白(一类醇溶蛋白)构成的负载阿莫西林的微球,具有有效的抗Ef活性;还发现通过改变玉米醇溶蛋白的含量,可调节阿莫西林的释放,使根管内的药物更有效,从而提高微球的消毒能力。另一种对Ef生物膜有效的抗菌策略是使用由纳米氧化石墨烯和吲哚菁绿(即通常用于医学诊断的花青染料,在光活化时具有抗微生物特性)制备的光触发药物递送系统。除了对Ef生物膜有效之外,与该分子的常规使用方式相比,使用更低浓度的活性吲哚菁绿制备的负载吲哚菁绿的纳米氧化石墨烯,细胞毒性更低,引起牙齿染色的可能性更小。

最近研发出的对于口腔生物膜有效的一种抗菌策略,是将核-壳化合物形式的银纳米颗粒用作根管冲洗液。银以其广谱抗菌活性著称,但是银纳米粒子在环境条件下具有颗粒聚集的趋势,导致其抗菌效果显著降低。为了克服这种缺点,该研究提出了使用多孔的二氧化硅壳来包埋银纳米颗粒的方法来提高纳米颗粒稳定性。该研究首次证实纳米技术在牙髓感染治疗中具有长期的抗菌能力。当与恰当的清洁剂组合时,核-壳银纳米粒子也可有效防止生物膜再生,并且比经典抗菌剂细胞毒性更低。

研究已证实,上述抗菌策略可有效控制根管内感染,可能成为牙髓再生领域与死髓年轻恒牙消毒有关的研究热点。该领域的未来研究应旨在最大限度增强抗菌效果的同时,尽量减少对干细胞存活和分化能力的损害。

牙髓再生治疗策略
无细胞移植法
使用干细胞归巢再生牙髓,是通过内源性、牙本质衍生的生长因子募集固有干细胞,诱导这些干细胞迁移到个体化支架中,以及促进干细胞的增殖和分化。利用可被吸附、束缚或包埋到支架中的外源性生物活性分子,以吸引邻近根管治疗牙根尖的干细胞/前体细胞,这种方法具有良好的临床应用前景。研究发现,仅仅将成纤维细胞生长因子(FGF-2)和/或血管内皮生长因子(VEGF)输送到根管中,而不进行干细胞移植,就可以再生出牙髓样组织。近期一些研究证实,某些冲洗液和药物可使特定的生物分子[例如组织生长因子-β1(TGF-β1)、FGF-2、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、血小板衍生生长因子(PDGF)和VEGF]释放,有利于宿主干细胞的活性和增殖,从而将细胞归巢机制整合,可为细胞提供更适宜的可持续环境。

生物分子(包括但不限于牙本质和牙髓中的生长因子和基质分子)的识别,为根管消毒后牙髓再生中利用这些信号分子提供了独一无二的机会。通过某些冲洗剂和药物释放这些生物分子,可避免使用非人类外源性生物分子。理想的调节剂可使牙本质的无机成分脱矿,有助于储存在牙本质基质中的生长因子或基质蛋白的释放。比如,乙二胺四乙酸(EDTA)是主要的根管冲洗液之一,根据最近的一项研究,当EDTA与牙本质直接接触10分钟时,EDTA能够诱导大量生长因子释放;相反,使用次氯酸钠冲洗不能诱导任何生物活性分子从牙本质中释放;值得注意的是,EDTA处理后的牙本质表面可趋化牙髓细胞,促进细胞黏附并分化为牙髓样细胞。临床上可行的细胞归巢方法如图1所示。

图1 示意图展示一种临床可行的细胞归巢方法,用于在死髓年轻恒牙中再生牙髓(a),以及再生过程中根管系统中可能发生的细胞归巢方法相关的一系列事件/阶段(b)。在图a中,根管系统的消毒对于清除细菌至关重要,然后使用EDTA溶液处理牙本质长达10分钟,这有助于内源性生长因子(GF)的释放;接下来,在超声荡洗下用盐水冲洗根管,收集GF。然后将含GF的溶液与支架材料的液体成分混合,形成载有GF的支架/水凝胶,将其注入根管系统,随后聚合(例如,通常由于支架材料中的光引发剂而发生光聚合)。为了封闭根管系统,建议使用生物活性材料充填。最后,必须进行随访,包括临床和影像学检查,直至牙髓-牙本质复合体完全再生。在图b中,负载GF的个体化支架中GF的存在,诱导趋化反应(即干细胞从根尖迁移),这是细胞归巢方法的第一个阶段。在趋化反应后,细胞开始在载有GF的支架内增殖,数量增加(第二阶段)。然后细胞附着在牙本质内表面(第三阶段),分化为牙髓样细胞(第四阶段)
细胞移植法
细胞移植是将外源性支架和/或干细胞移植到所需位点,以实现组织再生。细胞移植在牙科领域已广泛应用,它首先由Mooney等于1996年提出。该领域的最新进展,包括新型支架/干细胞构建体和治疗剂,证实组织工程可转化应用于牙髓再生治疗中。

有研究使用自组装纳米微球将牙髓干细胞递送到根管中,合成了一种由聚(左旋乳酸)-嵌段-聚-(左旋赖氨酸)构成,能够自组装成纳米纤维海绵微球的星形嵌段共聚物,可在体外支持 DPSC 增殖和牙本质涎磷蛋白表达。还有学者使用纳米微球递送生长因子,通过使用微球平台释放氟轻松(FA)以抑制炎症,同时也释放BMP-2以促进DPSC的牙源性分化;在体外系统中可观察到FA的恒定线性释放和BMP-2的快速释放,可抑制炎症和增强DPSC分化。

最近一项研究将基于甲基丙烯酰基明胶(GelMA)的水凝胶用于牙髓再生。GelMA由变性胶原组成,并保留RGD(即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)黏附结构域,并对基质金属蛋白酶敏感,从而增强细胞结合和基质降解。研究发现,细胞GelMA构建体可使牙根片段中形成高度细胞化和血管化的人DPSC/脐静脉内皮细胞衍生的牙髓样组织,并促进细胞附着于牙本质内表面,形成伸入牙本质小管中的细胞突以及修复性牙本质基质。总的来说,GelMA水凝胶更适合包裹细胞,并通过改变GelMA和光引发剂的浓度可以很容易地对其进行调节。近期一项研究使用可见光调节GelMA水凝胶,这更接近临床情况,因为临床上常见可见光光固化灯,并且对DNA和细胞功能产生。图2展示了以上策略潜在的临床转化应用。

图2 该示意图展示了通过使用可见光使GelMA聚合,制备预血管化的牙髓样组织构建体。首先将明胶与甲基丙烯酸酐混合,然后通过掺入苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂光引发剂和随后的细胞包埋来合成GelMA大分子单体,细胞包埋是在GelMA水凝胶中混悬细胞。然后将得到的负载细胞的水凝胶构建体置于根管中,使用光固化灯进行聚合。该图片经授权改编自Monteiro等的研究(Monteiro等,2018)
总结和展望

我们将过去几年取得的主要成果列举如下:①与骨髓或脂肪来源的间充质干细胞相比,DPSC具有更强大的血管和神经生成潜力;②将自体DPSC移植到犬的去髓根管中可实现全牙髓再生;③犬的去髓根管中可再生出完整的牙髓,并且冠方形成了牙本质,对其进行观察,可见炎症细胞数量减少,细胞死亡数量下降,神经突显著向外生长。其他临床前试验也证实了干细胞移植机制的有效性和安全性。基于多项研究结果以及现有信息,牙髓再生临床治疗成功的关键是研发出一种生物相容性消毒方法。例如专注于设计和合成具有患者特异性与细胞相容性的3D抗生素洗脱纳米纤维,用于根管内封药,目前正在开展临床前(动物)体内研究以验证其效果。此外,我们还需要开发出一种牙髓再生技术,使用负载或不负载干细胞和生长因子的支架,在无菌环境中促进牙髓和牙本质再生,以建立死髓牙治疗的新方法。

文章及图片来源:中国医学论坛报今日口腔